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細(xì)菌多重 PCR 快速檢測
簡介
多重 PCR 是一種在普通 PCR 基礎(chǔ)上建立的一種可以同時擴(kuò)增多個目的片段的檢測多種細(xì)菌分子生物學(xué)的技術(shù)，其利用多對特異性引物同時擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率，節(jié)省了成本。優(yōu)點(diǎn)在于檢測的速度快、準(zhǔn)確性高和操作簡單，特別適用于臨床、環(huán)境和食品檢測等領(lǐng)域。
原理
多重 PCR 技術(shù)是在常規(guī) PCR 的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)后的一種新型技術(shù)，其基本原理與常規(guī) PCR 相同，是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來達(dá)到目的片段的擴(kuò)增。
當(dāng) DNA 雙鏈處于 90 ℃ 高溫時，雙鏈 DNA 會解旋成單鏈 DNA；當(dāng)溫度降到 60 ℃ 左右時，引物與特定的靶序列相結(jié)合; 當(dāng)溫度升到 72 ℃ 時即為 DNA 聚合酶的最適溫度，在依靠多種 dNTPs 底物的基礎(chǔ)上再通過堿基互補(bǔ)配對原則從而完成單鏈 DNA 的延伸工作，最終完成 DNA 雙鏈的配對合成。
多重 PCR 與常規(guī) PCR 的區(qū)別在于同一個反應(yīng)體系中所加入的引物對數(shù)不同。多重 PCR 可以特異性擴(kuò)增出多條目的 DNA 片段。反應(yīng)體系的組成和 PCR 循環(huán)的條件需要經(jīng)過優(yōu)化以確保同時擴(kuò)增多個 DNA 片段。理論上只要 PCR 擴(kuò)增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限，但由于各種條件的限制，實(shí)際能夠擴(kuò)增的引物對數(shù)量是有限的（～1 000 對）。
材料與儀器
目的菌株（以金黃色葡萄球菌為例），胰蛋白胨，細(xì)菌 DNA 提取試劑盒，LB 液體培養(yǎng)基，LB 固體培養(yǎng)基；PCR 熱循環(huán)儀，PCR 擴(kuò)增儀等。
步驟
1、引物設(shè)計：選擇序列長度在 500 bp 以上的基因設(shè)計引物。先用 Primer 軟件，之后通過 Oligo 軟件和 BLASTN 算法進(jìn)行分析，選擇二聚體少，自身不會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，Tm 值在 60 ℃ 左右且與非 DNA 同源性較低的引物作為該基因的特異性引物，并送公司進(jìn)行合成。最好進(jìn)行引物評價實(shí)驗(yàn)。
2、提取目的菌株 DNA：吸取樣品勻液，5 000 r/min 離心后棄去上清，參照細(xì)菌 DNA 提取試劑盒進(jìn)行操作，提取樣品的基因組 DNA。
3、測定 DNA 濃度及純度： 當(dāng) 260 nm/280 nm 的比值在 1.8-2.0 之間表明提取的基因組 DNA 質(zhì)量較好。
4、多重 PCR 檢測：將所提取的基因組 DNA 作為模板，以設(shè)計的引物（SU4, smal，clfA）進(jìn)行多重 PCR 反應(yīng)，25 μL 多重 PCR 反應(yīng)體系為：2.5 Μl 10 X PCR Buffer，1.0 μL MgCl2（4 mM），2.5 μL dNTP Mixture（各 2.5 mM），0.5 μL Taq 酶（5.0 U），2.0 μL DNA 模板，引物（10umol），添加 SU4, smal，clfA 分別為 2.6 μL、0.5 μL、1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL。
5、PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋孩?94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 30 s；③ 58 ℃ 30 s；④ 72 ℃ 45 s；⑤ 72 ℃ 10 min。②-④步重復(fù) 30 次。
6、配置 1.5% 瓊脂糖凝膠，使用電泳檢測多重 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。
7、在 EB 液中染色 10~15 分鐘后置于凝膠成像儀下查看電泳條帶結(jié)果。
注意事項(xiàng)
1. 當(dāng)比值大于 2.0 表明提取的基因組 DNA 中 RNA 含量較高，應(yīng)加入一定量的 RNase 酶去除溶液中的 RNA。
2. 目的片段長度不盡相同，而較小片段總是優(yōu)先擴(kuò)增；
3. 各對引物最佳 PCR 條件不相同，較長的片段需要較長的延伸時間。為了保證最終擴(kuò)增產(chǎn)量的一致性，在優(yōu)化反應(yīng)條件的時候，盡可能選擇有利于較大片段的擴(kuò)增條件。
4. 多重 PCR 體系中，引物用量與擴(kuò)增的目的片段長度有著正比內(nèi)在關(guān)系，即擴(kuò)增片段越長，所需引物相對越多，另外引物間的相互影響會導(dǎo)致擴(kuò)增效果不佳。
5. DNA 聚合酶的最適濃度為每 25 uL 反應(yīng)體積中添加 2 U，實(shí)際根據(jù)擴(kuò)增效果進(jìn)行輕微調(diào)整。
6. 高鹽濃度會使長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物難于變性解鏈。因而長片段產(chǎn)物在低鹽濃度下擴(kuò)增效果較好，而短片段產(chǎn)物在高鹽濃度下擴(kuò)增效果較好。可以適當(dāng)提高 PCR 緩沖液濃度，或者提高 K+ 濃度至 70~100 mM。
7. 不同的細(xì)菌類型和樣品類型可能需要不同的提取和擴(kuò)增方法，需要根據(jù)具體情況選擇合適的方法。同時在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)時，需注意控制反應(yīng)條件和減少污染，以確保準(zhǔn)確性和可靠性。
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