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求助,做ELISA實驗老是失敗怎么辦?
這年頭，做科研的不會做ELISA實驗，都不好意思出門。做ELISA實驗容易，想要做好ELISA實驗還是有點難度的！求助，做ELISA實驗老是失敗怎么辦？今天恒遠生物小編為大家總結ELISA實驗經驗，讓大家避免掉入“坑”里，以后的ELISA實驗必定是一路綠燈！
酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA或ELASA）指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。
一、ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。ELISA實驗中有三種必要的試劑：
① 固相的抗原或抗體（用于結合到固相載體上）
② 標記的抗原或抗體（標記物）
③ 作用的底物（顯色劑，用于顯色）
二、ELISA實驗成功七要素：
①成功采集到樣品
②樣品保存妥當
③成功復溫樣品，確保沒有降解
④試劑盒質量沒問題
⑤成功做出標準曲線
⑥操作過程沒有出現差錯，編號沒有混亂
⑦顯色之后顏色明顯，且在檢測范圍之內
三、四種常見ELISA方法
1.直接ELISA
將抗原固定于ELISA板上，然后用酶標抗體直檢測抗原。
相較于其它類型的ELISA實驗，直接ELISA實驗步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應，測定結果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質蛋白都會與ELISA板結合，實驗背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結合的一抗，實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗，信號沒有被放大，降低了測定的靈敏度。
2.間接ELISA
先將抗原結合到ELISA板上，隨后分兩步進行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結合，隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。
與直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標記抗體，更經濟。間接ELISA還提供了更大的靈活性，因為不同的一抗能夠與單一標記的二抗一同使用。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應的可能性（酶標二抗直接與抗原結合），可能會增加背景，同時與直接ELISA相比，間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟，實驗周期延長。
3.夾心ELISA
先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中，然后加入樣品，接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標抗體，則可稱為直接夾心ELISA；如果檢測抗體不帶有標記，則還需要使用酶標二抗與檢測抗體結合，這種稱為間接夾心ELISA。
夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍；同時夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結合，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進行檢測，靈活性較高。夾心ELISA的缺點是對配對抗體要求很高，如果沒有標準化的試劑盒或者已經通過測試的配對抗體，則需要進行配對抗體定制并進行優化，因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應是非常重要的。
4.競爭ELISA法
預先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標記的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預先包被在固相載體上的抗原競爭結合酶標抗體；如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統中原有的酶標抗體競爭結合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結合的酶標抗體，最后加底物顯色。需要注意的是顯色結果與待檢抗原（或抗體）的量成反比。
競爭ELISA相對以上介紹的三種方法更復雜一些，但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優點在于可檢測不純的樣品，且數據再現性高，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。
四、ELISA常見問題與解決方法
1. 陰性對照出現陽性結果
① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當導致相鄰孔之間溶液濺灑出現交叉污染——更換試劑，小心操作。
② 酶標板洗滌不徹底——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒滿板孔，確保能充分洗滌。
③ 抗體量過多導致非特異性結合——根據說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當濃度。
2．酶標板整體背景高
① 抗體非特異性結合——應確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當的封閉液以防止非特異性結合。
② 底物結合濃度過高——對底物進行適當稀釋。
③ 反應時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數時立即使用終止液終止反應，適當縮短顯色時間。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應是澄清透明的，若出現黃色或其他顏色表明受到污染，應更換新的底物溶液。
⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應在避光條件下進行。
3. 復孔之間重復性差
① 樣品數量不整齊，加樣時間有長有短——加重復孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。
② 加樣量不一致——樣品稀釋前應充分混勻，并且使用同一移液槍。
③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復測定樣品時，操作條件、人員應盡可能與上次保持一致。
4. 吸光值偏高或偏低
① 樣品中待測抗原含量太低會導致測定結果偏低——可嘗試增加樣品使用量。
② 加入抗體量不合適會造成結果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結果更好盡可能調整抗體的最適用量。
③ 孵育時間太短導致檢測結果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結合。
④ 孵育溫度不適合——應保證抗體在最適宜條件下進行孵育（一般37℃孵育1h）。
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