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什么是細(xì)胞的活化與復(fù)蘇?
很多小伙伴做實(shí)驗(yàn)會(huì)用到細(xì)胞，那么我們?cè)谑盏郊?xì)胞時(shí)該如何處理呢？首先收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡快開(kāi)始培養(yǎng)，或立即冷凍保存。
細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：
必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。
一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。
3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。
二．取出凍存管：
1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。
2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。
三．迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。
四.平衡離心：
用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min
五.制備細(xì)胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：
細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。
七、冷凍細(xì)胞解凍程序
1.依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類(lèi)，若因?qū)嶒?yàn)需要，必須有所不同時(shí)， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。
2.FBS(fetal bovine serum,胚牛血清),CS(calf serum, 小牛血清)和HS(horse serum,馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類(lèi)培養(yǎng)之。
3.將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70% 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37°C 水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以70% ethanol擦拭冷凍管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)和濃度，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25或T75 flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
5.對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。唯對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO者。
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