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免疫組化實驗操作注意事項


免疫組化實驗是一項精密的技術(shù)操作,需要嚴格把控各個環(huán)節(jié)以確保結(jié)果的準確性和可靠性。以下是免疫組化實驗的關(guān)鍵注意事項:

一、血清封閉
血清封閉的目的是為了一抗與組織的非特異性結(jié)合,造成假陽性,一般會采用BSA、羊血清等封閉這些位點,封閉血清一般是和二抗同一來源的,室溫封閉10-30min。

二、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間
不同的一抗?jié)舛龋跤龝r間和溫度等對染色結(jié)果往往有較大的影響。在4℃下,反應(yīng)緩慢,背景較淺;而37℃反應(yīng)較快,時間較短;室溫介于兩者之間,二抗一般室溫孵育30min。

三、DAB顯色
檢測背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時間并不是固定的,主要方法是使用顯微鏡控制顯色時間,到出現(xiàn)特異性染色較強且出現(xiàn)背景著色較淺時就可以沖洗。如果DAB顯色時間過長(超過十分鐘)才出現(xiàn)陽性染色,可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長,也可以加入金屬離子來增強顯色(如硫酸銅、氯化鈷、硫酸鎳銨等);如果DAB顯色時間過短顏色就很深,這可能是一抗過高,需要下調(diào)抗體濃度,如果短時間內(nèi)過深

四、復(fù)染
免疫組化染色后為了襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有必要進行復(fù)染,常用試劑為Mayer’s蘇木染色,一般為2 min左右,DAB在核蛋白著色的時間可以適當(dāng)縮短,最后用氨水或PH 8.0的TBS返藍。

五、封片
在封片階段我們通常是用中性樹膠來進行,封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的產(chǎn)生從而對結(jié)果進行營影響,建議最好在通風(fēng)櫥操作,這樣有利于氣泡排除干凈,不影響后續(xù)的鏡檢。

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