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WB條帶大小和蛋白預(yù)測(cè)八字不合?先檢查這5點(diǎn)!
實(shí)驗(yàn)室玄學(xué)千千萬，預(yù)測(cè)和結(jié)果不符占一半。
WB實(shí)驗(yàn)是各位同學(xué)們，時(shí)常光顧的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。但就是這樣一個(gè)初級(jí)又常用的實(shí)驗(yàn)，卻會(huì)出現(xiàn)各種稀奇古怪的問題。比如在WB實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白時(shí)，我們得到的蛋白質(zhì)條帶大小常常會(huì)和預(yù)測(cè)值有所偏差。這是身患“強(qiáng)迫癥”的同學(xué)們不能忍的。如果是實(shí)驗(yàn)出錯(cuò)或者預(yù)測(cè)不準(zhǔn)這種情況，小編是沒辦法跳出手機(jī)屏幕救你了。但這下面的 5 條準(zhǔn)則，同學(xué)們倒是可以珍藏一下，在遇到蛋白質(zhì)條帶大小和預(yù)測(cè)值偏差的時(shí)候，拿出來分析一下。
一、內(nèi)源性蛋白o(hù)r重組蛋白
查問題要從源頭查起，所以各位艾粉們要先看一看樣品是內(nèi)源性蛋白還是重組蛋白?
如果是內(nèi)源性蛋白還不打緊，如果是重組蛋白，那么馬上就要看一看重組蛋白是否為全長(zhǎng)序列了。假如樣品是重組蛋白，還不是全長(zhǎng)序列，那么條帶大小一定會(huì)和預(yù)測(cè)大小不一致。
二、多個(gè) isoform 辨仔細(xì)
如果確定了樣品是內(nèi)源蛋白，那就要看看我們的目標(biāo)蛋白是不是有其他的 isoform，這個(gè)我們通常會(huì)去查看 NCBI 或者 SWISSPROT 來確認(rèn)。
三、剪切活化要注意
如果在 SWISSPROT 或者權(quán)威的文獻(xiàn)里提到了，樣品的這個(gè)蛋白需要剪切活化，那么結(jié)果又要和預(yù)測(cè)值不同啦。
四、成倍增長(zhǎng)多聚體
如果蛋白大小和預(yù)測(cè)值有明顯倍數(shù)關(guān)系，那就要考慮一下這個(gè)蛋白是不是二聚體或者多聚體啦。
五、蛋白修飾要變大
如果排除了以上 4 條原因，預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，那就是因?yàn)槲覀兠鎸?duì)的蛋白質(zhì)，是個(gè)善變的對(duì)象，它不僅會(huì)剪切活化，還有在翻譯表達(dá)后修飾。比如：比如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、烷基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、硫酸化、異戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巰基乙胺基化……。在不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)還會(huì)有不同的修飾。加入了官能團(tuán)肯定會(huì)讓蛋白質(zhì)比預(yù)測(cè)值偏大。在日常的實(shí)驗(yàn)中，糖基化是比較常見的修飾，一般會(huì)導(dǎo)致跑出來的條帶比預(yù)測(cè)值大那么一些。
總結(jié)：
1.確定蛋白是內(nèi)源的還是外源的，如果是外源蛋白是不是全長(zhǎng)序列;
2.SWISSPROT 數(shù)據(jù)庫查詢?cè)摰鞍资欠裼衅渌?isoform;
3.SWISSPROT 和文獻(xiàn)查詢蛋白質(zhì)是否有剪切活化，剪切活化造成蛋白變小;
4.確定蛋白質(zhì)是否是二聚體或多聚體。
5.NCBI 和 SWISSPROT 查詢蛋白質(zhì)表達(dá)后是否有修飾，如有修飾會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)增大;
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